Hasil Analisis Kromatografi kolom

PRAKTIKUM ANALISIS KROMATOGRAFI KOLOM

Judul :

Analisis yang telah dilakukan adalah analisis kromatografi kolom yaitu 

memisahkan klorofil yang ada dalam daun suji.

Tujuan :

Analisis ini dilakukan dengan tujuan memisahkan suatu komponen yang terdapat

dalam daun suji yaitu klorofil.

Prinsip Percobaan :

Analisis kromatografi kolom dilakukan untuk pemisahan, pemurnian komponen dalam suatu campuran . Dalam analisis kromatografi kolom ini menggunakan metode basah yaitu dengan cara adsorben yang digunakan terlebih dahulu di buat bubur kolom.

Teori Dasar :

Kromatografi kolom umumnya digunakan sebagi teknik pemurnian untuk mengisolasi komponen yang diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak 9cairan) ditempatkan pada bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan terjadi antara komponen yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi mengalir melewati kolom.

Klasifikasi Kromatografi Kolom

1. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben

1. Kromatografi adsorbsi

Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. 

2. Kromatografi partisi

Dalm kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang bertindak sebagai fase gerak.

3. Komatografi petukaran ion

Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase gerak.

4. Komatogrfi filtrasi gel

Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan.

2. Berdasarkan gatya yang bekerja pada kolom

Kromatografi kolom kategori ini tergantung pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom, terdiri dari kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi kolom tekanan.

1. Kromatografi kolom gravitasi

Dalm komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi.

2. Kromatografi kolom tekanan

Adsorben

Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.

Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum disunakan untuk kromatografi kolom. Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika tersebut lebih kecil.

Ukuran partikel dari adsorben sngat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi.

Alumina lebih sering digunakan dalam komtografin kolom dibanding kromtografi lapis tipis. Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. CAranya ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360OC selma 5 jam, kemudian membiarkan alumina kering  tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu. Aktivitasnya tergantung dri kadar irnya dan dinyatakan dalam skala Brockman.

Pelarut

Pelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom. Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama.

Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi kolom. Dalm hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polah ditambahkan untuk mengelusi komponen yang lebih polar juga.

Teknik Pengoperasian dalam Kromatografi Kolom

Peralatan

a.   Wadah eluen (fase gerak).

Untuk peralatan komersil dilengkapi dengan pengatur tekanan.

b.  Kolom

Biasanya terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian dasar dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap dalam keadaan statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir kuarsa yang dikemas dengan kolom.

c.   Wadah penampung

Eluat dari kolom ditampung dalam bentuk fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat dilakukan secara manual, namun jik total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang diinginkan dalam volume kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal ini biasanya digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor.

Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Gravitasi

a.       Pengemasan Kolom

Pemngemasan kolom adalah salah satu faktor penting untuk untuk mempeoleh hasil pemisahan yang baik. Ada 2 cra pengemasan kolom (packing0 dalm komtografi kolom gravitasi yaitu :

1.      Metode basah

Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan ke dalam kolom. Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat dihilangkan dari kolom.

Contoh pengerjaan : kolom diisi dengan pelarut non polar seperti hekasana kira-kira setengah dai tinggi kolom gels. Ditimbang sebnyak 8 gram alumina dalam gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml heksana. Dengan perlahan serbuk alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk. Gunakan pipet pasteu untuk membut bubur, kemudian dengan cepat bubur tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalm kolom. Tempatkan erlenmeyer di bawh kolom kemudian buka screw clamp dan biarkan pelarut mengalir. Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis, jangan lupa penambahan pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang keluar dapat ditampung dan digunakan kembali untuk packing/menambah lagi alumina ke dalam kolom. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi cairan minimal sma dengan tinggi alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan pda puncak kolom untuk mencegah dari gangguan saat pelaut baru ditambahkan.

2.      Metode kering

Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung udara dalam kolom. Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan mengurangi resolusi dari pemisahan.

Contoh pengerjaan : Bagian dasar dari kolom diisi dengan glass woll secukupnya. Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan pelrut. Masukkan 8 gram alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan pelarut mengalir. Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai dan tinggi pelarut minimal sama dengn tinggi alumina. Demikian juga hindai agar kolom tidak kering.

Pebandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter kolom yang optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik, sulit dinyatakan secara tepat dan ini dilakukan secara coba-coba secara sistematis. Secara umum, hanya dapat dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan memberikan tingkat pemishan yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik untuk memisahkan komponen-komponen dalam jumlah besar. Jenis fase diam yang digunakan adalah silika gel dan alumina.

b.      Aplikasi sampel dan Proses Elusi

Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dikeluarkan sedemikian rupa hingga cairan di atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan pada bagian atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes. Sejumlah kecil pengelusi (fase gerak) digunakan untuk mencuci sissa sampel dalam wdah sampel dan selnjutnya dimsukkan ke dalam kolom.

Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah lagi eluen sedemikian rupa hingga ketinggian fase gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya, hubungkan dengan wadah fase gerak (proses elusi dilakukan) dan alirkan pengelusi sedemikin rupa sehingg ketinggian cairan di atas fse diam dipertahankan. Proses elusi dilakukan sampai komponen yang diinginkan keluar dari kolom.

c.       Pengumpulan Fraksi

Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan tabung reaksi yang sebekumnya diberi tanda sesuai dengan volume yang diinginkan atau pada waktu tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan ini dapat juga dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor fraksi. Jika tidak ada prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang harus dikumpulakn maka biasanya diambil pendekatan yakni 2-5% dari volume total (cair+padat).

d.      Deteksi Komponen

Deteksi komponen dapat dilakukan dengan teknik analisis seperti cara-cara spektoskopi, KLT, dsb.

Prosedur Untuk Kromatografi Kolom Tekanan Skala Mikro

Kromatografi kolom tekanan skala mikro meupakan metode yang paling seing digunakan dalam laboratorium kimia organik karena mudah dilakukan dn ramah lingkungan. Pemisahan terbaik jika jumlah sampel berkisar 25 mg.

a.       Pengemasan kolom

Kolom dikemas dengan metode kering. Bagian bawah pipet pasteur disumbat dengan kapas secukupnya. Tambahkan silika gel kering 230-400 mesh.

b.      Pra elusi kolom

Untuk digunakan pelarut non polar sepeti hekasana. Heksana ditambahkan pada bagian atas kolom (silika gel). Pelarut akan bergerak dengan perlahan, proses pra elusi dpat dipercepat dengan bantuan bulb pipet untuk mendorong pelarut melewati silika gel. Ketika batas pelarut sudh mencapai batas bawh dari kolom, proses elusi selesai dan kolom siap digunakan.

c.       Aplikasi sampel

1.      Metode basah

Sampel dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut sepeti heksana, aseton dan sebagainya. Larutan ini kemudioan dimasukkan ke dalam kolom.

2.      Metode kering

Sampel dilarutkan salam sejumlah kecil pelaut dan tambahkan 100 mg silika gel. Tunggu sampai pelarut menguap sehingga yang tertinggal hanya serbuk kering. Masukkan sampel ke dalam kolom dengan bantuan kertas. Tambahkan pelarut segar ke dalam kolom dan proses elusi pun siap dimulai.

d.      Elusi kolom

Proses elusi untuk kromatografi kolom tekanan berskala mikro dilakukan dengan cara menekan bulb yang ada di ujung pipet pasteur sehingga pelarut akan bergerak melewati kolom. Jangan biarkan fase diam sampai mengering. Jika kita ingin memisahkan campuran yang mengandung lebih dari satu komponen maka kita harus mengubah kepolaran dari sistem pelarut yang digunakan sebelumnya.

e.       Analisis fraksi

Jika fraksi yang diperoleh berwarna, kita dapat menggabungkan fraksi berdasarkan kesaman warna tapi jika fraksinya tidak berwarna, penggabunagn fraksi dapat dilakukan bedasrkan hasil KLT.

Alat yang digunakan :

1.      Wadah Kolom

2.      Glass woll

3.      Gelas Ukur 10 ml

4.      Corong

Bahan/Pereaksi :

a.       N-Heksan

b.      Aseton

c.       Sample Klorofil

 Cara Kerja :

1.      Pelarutan klorofil Sample klorofil

Sample klorofil dilarutkan dalam 2 ml n-heksan dan 1 ml aseton.

2.      Pembuatan bubur kolom

Silika gel dimasukan ke dalam beaker glass, kemudian ditambahkan 7:3 N-Heksan dan aseton sampai basah.

3.      Memasukan bubur kolom ke dalam pipet

Setelah dibuat bubur kolom, maka pipet diisi dengan glass woll, kemudian dimasukan n-heksan dan aseton, kemudian bubur yang telah basah, dimasukan ke dalam wadah kolom, sampai wadah kolom tersebut padat oleh kolom, setelah padat, maka atasnya diberi glass woll kembali, cerat dibuka sampai silika gell semua basah.

4.      Memasukan sample ke dalam kolom kromatografi

Sample yang telah dilarutkan, kemudian dimasukkan ke dalam kromatografi kolom. Amatilah sampai terbentuknya cincin.

Data Pengamatan :

Tidak ada cincin yang terbentuk.

Pembahasan :

Setelah dilakukan praktikum analisis kromatografi dengan cara basah ini, setelah diamati hasil yang didapatkan tidak terbentuk cincin, hal ini dapat dipengaruhi karena bubur kolom yang masukan ke dalam kolom, tidak padat, sehingga dapat menambah rongga udara dalam kolom tersebut, maka cincin tidak akan terbentuk karena terhalang oleh uadara yang ada dalam kolom.

Kesimpulan :

Jadi setelah melakukan praktikum analisis kromatografi kolom dengan metode basah, hasil yang didapatkan tidak terbentuk cincin pada kolom kromatografi.